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引   言

生牛乳中富含多種天然活性蛋白，如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳過氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等，這些天然活性蛋白在抵抗細菌、病毒入侵，增強免疫力，促進組織修復和生長發育等方面發揮著重要作用。其中乳鐵蛋白能夠參與機體鐵代謝，促進體內鐵元素的吸收和運輸，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力的功能。不同的熱處理方式（巴氏殺菌、超高溫 (UHT) 滅菌、蒸發濃縮及噴霧干燥等），會導致乳制品中乳鐵蛋白出現不同程度的變性失活，從而影響其營養價值及市場售價。

賽默飛新國標應對方案亮點

1. 本試驗參考 GB 5009.299-2024、NY/T 4439-2023 以及相關團體標準和企業標準，對巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的含量進行測定。

2. 為獲得良好的峰形和分離度，試驗對樣品前處理和液相色譜條件進行了適當優化，在柱溫 30 ℃、流速 1.0 mL/min 條件下，以 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動相進行梯度洗脫，系統最大壓力值不超過 106 bar。

3. 試驗結果表明：乳鐵蛋白標準品溶液 (50.0 μg/mL) 色譜峰不對稱因子 1.00，峰形良好，理論塔板數 30549，柱效優異；連續三次進樣，保留時間和峰面積的 RSD 均小于 1%，方法重現性好；線性低點 (1.00 μg/mL) 信噪比為 8.2，方法靈敏度較高；線性范圍 1.00-200 μg/mL，線性相關系數 r2≥0.9998，線性良好。

4. 在反相液相色譜法測定乳制品中乳鐵蛋白含量的試驗中，BioBasic 4 色譜柱（孔徑 300 Å）配合 Vanquish Core 高效液相色譜系統，表現出了良好的重現性和優異的穩定性，方法檢出限和定量限均滿足標準要求，可供乳制品企業及食品檢測實驗室參考。

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GB 5009.299-2024

 賽默飛完整應用解決方案

01

樣品前處理

1.1 試樣提取

1.1.1 液體試樣：低溫奶（生牛乳、巴氏殺菌乳）/ 常溫奶（超高溫 (UHT) 滅菌乳）

稱取試樣 5 g（精確到 0.1 mg）于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中，用磷酸鹽緩沖液Ⅱ定容至 25.0 mL，渦旋振蕩提取 3 min，12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。室溫靜置，去除上層浮脂，取上清液待凈化。

1.1.2 固體試樣：乳粉（嬰幼兒配方奶粉）

稱取試樣 2 g（精確到 0.1 mg）于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中，加適量磷酸鹽緩沖液Ⅱ溫熱振搖溶解，用磷酸鹽緩沖液Ⅱ定容至 50.0 mL，渦旋震蕩提取 3 min ，靜置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。室溫靜置，去除上層浮脂，取上清液待凈化。

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1.2 試樣凈化

1.2.1 活化：HyperSep 肝素親和柱 (P/N: 60105-110-B) 下端 Luer 接頭連接至固相萃取裝置，上端通過適配器 (P/N: 60104-259) 串聯 10 mL 注射器空筒， 加入 2×5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅱ活化肝素親和，控制滴速 2d/3s；

1.2.2 上樣：待活化步驟液面接近小柱篩板時，準確移取 10.0 mL 上述樣液至注射器空筒 (P/N: S7510-10) 中，控制滴速 2d/3s，棄去流出液；

1.2.3 淋洗：待上樣步驟液面接近小柱篩板時，加入 2×5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅱ淋洗小柱，棄去流出液，移除適配器和注射器空筒，負壓抽干小柱 2 min；

1.2.4 洗脫：加入 2×2.5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅰ洗脫，收集全部洗脫液，并用磷酸鹽緩沖液Ⅰ定容至 5.00 mL，過 0.2 μm 親水性 PTFE 針式過濾器 (P/N: 42213-NPL) ，濾液待上機測試。

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02

儀器配置及色譜條件

Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高效液相色譜系統，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自動進樣器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱溫箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，檢測器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，數據處理 Chromeleon™ 7.3

色譜柱：BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 72305-254630)

流動相：A: 0.1% 三氟乙酸水 B: 0.1% 三氟乙酸乙腈

流速：1.0 mL/min

梯度洗脫程序：

進樣量：50 µL

柱溫：30 ℃

檢測器：DAD, 采集波長: 280 nm；采集頻率: 5 Hz；光譜采集: 190-400 nm

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03

譜圖及數據

3.1 乳鐵蛋白標準品溶液的分離譜圖及數據

圖 1 乳鐵蛋白標準品溶液的分離譜圖及數據 (50.0 μg/mL)（點擊查看大圖）

如圖 1 所示，乳鐵蛋白標準品溶液 (50.0 μg/mL) 保留時間為 12.137 min，色譜峰形良好，不對稱因子 1.00，柱效優異，理論塔板數 30549。乳鐵蛋白在 280 nm 處有特征吸收峰。

3.2 乳鐵蛋白標準品溶液連續進樣疊加譜圖

圖 2 乳鐵蛋白標準品溶液連續進樣疊加譜圖 (50.0 μg/mL, n=3)（點擊查看大圖）

乳鐵蛋白標準品溶液 (50.0 μg/mL) 連續三次進樣，保留時間和峰面積的 RSD 均小于 1%，方法重現性好，分離譜圖及數據詳見圖 2。

3.3 乳鐵蛋白標準品溶液校準曲線疊加譜圖

圖 3 乳鐵蛋白標準品溶液校準曲線疊加譜圖 (1.00/5.00/10.0/50.0/100/200 μg/mL)（點擊查看大圖）

如圖 3 所示，乳鐵蛋白標準品溶液線性范圍 1.00-200 μg/mL，線性相關系數 r2≥0.9998，線性良好。

3.4 乳鐵蛋白標準品溶液線性最低點與空白溶液疊加譜圖

圖 4 乳鐵蛋白標準品溶液線性最低點 (1.00 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖（點擊查看大圖）

當進樣體積為 50 uL 時，以乳鐵蛋白 (1.00 μg/mL) 的峰高為 S，選取 10.5-11.5 min 基質噪音的平均值為 N，線性低點信噪比 S/N=8.2，如圖 4 所示，乳鐵蛋白測定方法靈敏度相對較高。

3.5 在 0.1% 三氟乙酸水-乙腈流動相體系下，乳鐵蛋白的標準品溶液的峰形及響應

圖 5 在 0.1% 三氟乙酸水-乙腈流動相體系下，乳鐵蛋白的標準品溶液疊加譜圖（點擊查看大圖）

如圖 5 所示，當流動相 B 為純乙腈時，乳鐵蛋白峰形會出現嚴重拖尾，導致線性最低點 (1.00 μg/mL) 響應較差，無法自動積分，方法檢出限不能滿足標準要求。綜合乳鐵蛋白行業標準 NY/T 4439-2023 和團體標準 T/TDSTIA 006-2019 推薦的色譜條件，本試驗最終選擇 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動相進行梯度洗脫，且系統最大壓力值不超過 106 bar。

3.6 巴氏殺菌乳（低溫奶）、超高溫滅菌乳（常溫奶）及嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖

圖 6 巴氏殺菌乳（低溫奶）樣品溶液分離譜圖

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圖 7 超高溫滅菌乳（常溫奶）樣品溶液分離譜圖

（點擊查看大圖）

圖 8 嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖及數據

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乳鐵蛋白對溫度非常敏感‌，高溫會破壞其化學結構及生物活性，使得肝素親和柱無法有效富集。如圖 6-8 所示，巴氏殺菌乳（低溫奶）中乳鐵蛋白含量為 13.4 mg/kg；而超高溫滅菌乳（常溫奶）和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白均為未檢出。

04

GB 5009.299-2024 相關色譜耗材推薦

分析柱及保護柱

BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm

(P/N: 72305-254630)

BioBasic 保護柱柱芯, 5 μm, 4.0×10 mm, 4 pk

(P/N: 72305-014001)

Uniguard 直連式保護柱柱套

(P/N: 850-00)

樣品前處理

HyperSep 肝素親和柱，3 mg, 10/pk

(P/N: 60105-110-B)

HyperSep 玻璃室真空固相萃取裝置，16 位

(P/N: 60104-232)

適配器，適用于 1 mL、3 mL、6 mL SPE 小柱轉接，15/pk

(P/N: 60104-259)

National Target 全塑料一次性注射器，Luer-Slip, 10 mL, 100/pk

(P/N: S7510-10)

Titan 3 親水性 PTFE 針式過濾器，17 mm, 0.2 μm, 200/pk

(P/N: 42213-NPL)

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