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北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司上海辦事處 (上海天崛電子科技有限公司)

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公司動(dòng)態(tài)

細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定

點(diǎn)擊次數(shù):561 發(fā)布時(shí)間:2010-1-25

式中Kd為 Fura-2與Ca 結(jié)合反應(yīng)的介離常數(shù),37℃時(shí)其值為224nmol/L,Fmax是細(xì)胞內(nèi)Fura-2全部為Ca 飽和時(shí)的熒光比值(采用Ca 載體),F(xiàn)min為Fura-2*未結(jié)合Ca 時(shí)的熒光比值。通過(guò)向介質(zhì)中加入過(guò)量的EGTA將細(xì)胞內(nèi)外的游離Ca 螯合,此時(shí)測(cè)得的zui小熒光值。F為實(shí)驗(yàn)中以340nm和380nm波長(zhǎng)激發(fā),500nm波長(zhǎng)發(fā)射測(cè)定負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞的熒光比值。

 

靜息態(tài)時(shí)[Ca ]i<0.1umol/L。[Ca ]0濃度為1~1.5mmol/L,細(xì)胞內(nèi)外[Ca ]相差104。細(xì)胞膜內(nèi)外的[Ca ]差是細(xì)胞外的Ca 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的推動(dòng)力。

組織細(xì)胞以12.5%胰蛋白酶消化20-30 min)

37溫育10min, 加入Fura-2/AM(終濃度為2-5ug/ml),37℃恒溫震蕩45 min,負(fù)載后細(xì)胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hank’s液洗2次,用Hank’s液調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106,測(cè)定前37℃復(fù)溫5-10 min。

37℃溫育10 min,測(cè)熒光(負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞的熒光比值F)

Triton X 100 100μl

37℃溫育5 min

340nm測(cè)熒光(zui大值Fmax)

20℃水浴5 min

冰浴 2 min

EGTA 80μl(40mM

水浴5 min → 冰浴 5 min

380 nm 測(cè)定熒光(zui小值Fmin)



 

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